Opções binárias de imagej

O que os diferentes comandos binários fazem?

Este submenu contém comandos que processam imagens binárias (preto e branco). Esses comandos assumem que, por padrão, os objetos são pretos e o plano de fundo é branco. Veja este FAQ sobre como definir o padrão para fundo preto e objetos brancos.

Faça binário

Converte imagens em imagens em preto e branco. O nível de limite é determinado analisando o histograma da seleção atual ou da imagem inteira, se não houver seleção. Veja esta FAQ descrevendo o algoritmo usado.

Se a ferramenta Image & gt; Adjust & gt; Threshold estiver ativa, será exibida uma caixa de diálogo que permitirá especificar quais pixels estão definidos para a cor do plano de fundo e qual a cor do primeiro plano e se o plano de fundo é preto e se o branco é branco.

[por favor atualize o acima pode não estar totalmente correto]

Com pilhas, todas as imagens na pilha são convertidas em binário usando o limite calculado da fatia atualmente exibida. Use a macro ConvertStackToBinary para converter uma pilha em binário usando limites calculados localmente.

Converta em Máscara.

Converte imagens em imagens em preto e branco com base nas configurações de limite atuais. Por padrão, a máscara terá uma LUT invertida (preto é 255 e branco é 0), mas cria máscaras de fundo preto (0) se “Black Background” estiver marcado na caixa de diálogo Processar> Binário & gt; Opções.

[por favor atualize, o anterior pode não estar totalmente correto]

Encontre o Maxima.

Determina os máximos locais em uma imagem e cria uma imagem binária (semelhante a máscara) do mesmo tamanho com os máximos, ou uma partícula segmentada por máximo, marcada. Para imagens RGB, máximos de luminância são selecionados, com a luminância definida como média ponderada ou não ponderada das cores, dependendo das configurações de Editar & gt; Opções & gt; Conversões. Este comando é baseado em um plugin contribuído por Michael Schmid.

Uma caixa de diálogo é exibida com as seguintes opções:

Tolerância ao ruído - Os máximos são ignorados se não se distinguirem do ambiente mais do que este valor (unidades calibradas para imagens calibradas). Em outras palavras, um limite é definido no valor máximo menos a tolerância a ruído e a área contígua ao redor do máximo acima do limite é analisada. Para aceitar um máximo, esta área não deve conter nenhum ponto com um valor maior que o máximo. Apenas um máximo dentro desta área é aceito.

Máxima Dentro da Tolerância - Cria uma imagem de saída com todos os pontos dentro da “Tolerância ao Ruído” para cada máximo.

Partículas segmentadas - parte do princípio de que cada máximo pertence a uma partícula e segmenta a imagem por um algoritmo de bacias hidrográficas aplicado aos valores da imagem (em contraste com Process & gt; Binary & gt; Watershed, que usa o mapa de distância Euclidiano).

Seleção de pontos - Exibe uma seleção de vários pontos com um ponto em cada máximo; não produz uma imagem de saída separada.

Contar - Exibe o número de máximos na janela Resultados; produz nenhuma imagem de saída.

Exclude Edge Maxima - Exclui maxima se a área dentro da tolerância ao ruído em torno do máximo tocar a borda da imagem (a borda da seleção não importa).

Fundo claro - Permite o processamento de imagens com fundo claro e objetos escuros.

Acima do limite inferior - (esta opção aparece apenas para imagens limitadas) Localiza máximas acima apenas do limite inferior. O limite superior da imagem é ignorado. Se Partículas segmentadas for selecionada como Tipo de saída, a área abaixo do limite inferior será considerada um plano de fundo. Esta opção só funciona ao encontrar o máximo do valor do pixel no sentido matemático, ou seja, fundo escuro e LUT não invertido ou fundo brilhante e inversão de LUT.

Seleção do ponto de pré-visualização - Exibe o máximo com os parâmetros atuais como uma seleção multiponto sobreposta na imagem. Se esta opção estiver marcada, o número de máximos encontrados também é exibido na caixa de diálogo.

Para os tipos de saída Pontos Únicos, Máxima Dentro da Tolerância e Partículas Segmentadas, saída é uma imagem binária, com primeiro plano 255 e fundo 0, usando uma LUT invertida ou normal dependendo da opção Fundo Preto em Processar> Binário & Opções. O número de partículas (conforme obtido por Analyze Particles) na imagem de saída não depende do tipo de saída selecionado. Note que Partículas Segmentadas geralmente resultarão em partículas tocando a borda se Excluir Margem Máxima estiver selecionado. Exclude Edge Maxima aplica-se ao máximo, não à partícula.

Encontre o Maxima aplicado a uma imagem barulhenta com diferentes opções (Excluir Edge Maxima selecionado).

Encontre o Maxima não funciona em pilhas, mas a macro FindStackMaxima o executa em todas as imagens de uma pilha e cria uma segunda pilha contendo as imagens de saída.

Substitui cada pixel pelo valor mínimo (mais claro) na vizinhança 3 & tempos; 3. Com imagens binárias, remove pixels das bordas de objetos pretos.

Substitui cada pixel pelo valor máximo (mais escuro) na vizinhança 3 & tempos; 3. Com imagens binárias, adiciona pixels às bordas de objetos pretos.

Executa uma operação de erosão, seguida de dilatação. Com imagens binárias, isso suaviza objetos e remove pixels isolados.

Executa uma operação de dilatação, seguida de erosão. Com imagens binárias, isso suaviza objetos e preenche pequenos furos. O comando tem um hífen residual para diferenciá-lo de “fechar arquivo”.

Exibe uma caixa de diálogo que permite que várias configurações usadas pelos comandos no submenu Binário sejam alteradas.

Iterações especifica o número de vezes que erosão, dilatação, abertura e fechamento são realizadas.

Contagem especifica o número de pixels de fundo adjacentes necessários antes que um pixel seja removido da borda de um objeto durante a erosão e o número de pixels de primeiro plano adjacentes necessários antes que um pixel seja adicionado à borda de um objeto durante a dilatação.

Verifique o fundo preto se a imagem tiver objetos brancos em um fundo preto.

Se a opção Bordas do bloco quando a erosão estiver marcada, Processar> Binário & gt; Erode não será erodido a partir das bordas da imagem. Essa configuração também afeta o Processo & gt; Binário & gt; Fechar, que é eliminado das bordas, a menos que essa caixa de seleção esteja marcada.

A saída de EDM determina o tipo de saída para os comandos Processar & gt; Binário & gt; Distância do mapa, Pontos finais e Voronoi. Defina para sobrescrever a saída de 8 bits que sobrescreve a imagem de entrada; 8 bits, 16 bits ou 32 bits para imagens de saída separadas. Saída de 32 bits tem resolução de distância de ponto flutuante (subpixel).

Gera um contorno amplo de um pixel de objetos em primeiro plano (preto) em uma imagem binária. A linha é desenhada dentro do objeto, ou seja, em pixels de primeiro plano anteriores.

Esqueletizar.

Repetidamente remove pixels das bordas de objetos em uma imagem binária até que eles sejam reduzidos a esqueletos de um único pixel. Os objetos são assumidos como preto e branco como plano de fundo. Note que existem muitos algoritmos esqueletizantes.

Mapa de distância.

Gera um mapa de distância euclidiano (EDM). Cada pixel de primeiro plano na imagem binária é substituído por um valor de cinza igual à distância desse pixel do pixel de fundo mais próximo. Use Process & gt; Binary & gt; Opções para definir a cor de fundo (preto ou branco) e o tipo de saída; Ao selecionar substituir ou saída de 8 bits, observe que as distâncias maiores que 255 são rotuladas como 255.

Pontos finais.

Gera os pontos finais erodidos (UEPs) do EDM. Requer uma imagem binária como entrada. Os UEPs representam os centros de partículas que seriam separados por segmentação. O valor cinzento da UEP é igual ao raio do círculo inscrito da partícula correspondente. Use Processar> Binário & gt; Opções para definir a cor de fundo (preto ou branco) e o tipo de saída.

A segmentação de bacias hidrográficas do mapa de distância euclidiano (EDM) é uma maneira de separar ou cortar automaticamente as partículas que se tocam (a separação de bacias hidrográficas de uma imagem em escala de cinza está disponível por meio do comando Find Maxima.). O comando Watershed requer uma imagem binária contendo partículas pretas em um fundo branco. Primeiro, calcula o mapa de distância euclidiano e encontra os pontos finais erodidos (UEPs). Em seguida, dilata cada um dos UEPs (os picos ou máximos locais do EDM), tanto quanto possível - até que a borda da partícula seja atingida, ou a borda da região de outro UEP (crescente). A segmentação de bacias hidrográficas funciona melhor para objetos convexos suaves que não se sobrepõem em demasia.

Aqui está uma animação que mostra como funciona a segmentação de bacias hidrográficas.

Divide a imagem por linhas de pontos tendo igual distância às bordas das duas partículas mais próximas. Assim, a célula de Voronoi de cada partícula inclui todos os pontos que estão mais próximos desta partícula do que qualquer outra partícula. Para o caso das partículas serem pontos únicos, esta é uma tesselação de Voronoi (também conhecida como tesselação de Dirichlet).

Na saída, o valor dentro das células de Voronoi é zero; os valores de pixel das linhas divisórias entre as células são iguais à distância das duas partículas mais próximas. Isso é semelhante a uma transformação do eixo medial do plano de fundo, mas não há linhas nos orifícios internos das partículas. Escolha o tipo de saída ("Overwrite", "8-bit", "16-bit" ou "32-bit") e cor de fundo (preto ou branco; aplica-se a entrada e saída) na caixa de diálogo Processar> Opções binárias & gt; caixa.

Menu Processo.

Encontre bordas.

Encontre o Maxima.

É apresentada uma caixa de diálogo com as seguintes opções: "Tolerância ao ruído" - os máximos são ignorados se não se distinguirem dos arredores mais do que este valor (unidades calibradas para imagens calibradas). Em outras palavras, um limite é definido no valor máximo menos a tolerância a ruído e a área contígua ao redor do máximo acima do limite é analisada. Para aceitar um máximo, esta área não deve conter nenhum ponto com um valor maior que o máximo. Apenas um máximo dentro desta área é aceito. "Tipo de Saída" pode ser: "Pontos Únicos" - resulta em um único ponto por máximo "Máxima Dentro da Tolerância" - todos os pontos dentro da "Tolerância ao Ruído" para cada máximo "Partículas Segmentadas" - assume que cada máximo pertence a uma partícula e segmenta a imagem por um algoritmo de bacias hidrográficas aplicado aos valores da imagem (em contraste com Process & gt; Binary & gt; Watershed, que usa o mapa de distância Euclidiano). "Display Point selection" - Exibe uma seleção multiponto com um ponto em cada máximo "Count" - Exibe o número de máximos na janela Resultados "Exclude Edge Maxima" - Exclui maxima se a área dentro da tolerância ao ruído em torno de um máximo toca a borda da imagem (borda da seleção não importa). Verifique o Fundo claro se o fundo da imagem for mais brilhante do que os objetos que você deseja encontrar, como na imagem da Cell Colony na ilustração acima. "Acima do limite inferior" - (Esta opção aparece apenas para imagens limitadas.) Localiza valores máximos acima apenas do limite inferior. O limite superior da imagem é ignorado. Se "Partículas segmentadas" for selecionado como "Tipo de saída", a área abaixo do limite inferior será considerada um plano de fundo.

A saída é uma imagem binária, com primeiro plano 255 e fundo 0, usando uma LUT invertida ou normal, dependendo da opção "Fundo preto" em Processar> Binário & gt; Opções. O número de partículas (conforme obtido por "Analyze Particles") na imagem de saída não depende do "Output Type" selecionado. Observe que "Partículas segmentadas" geralmente resultará em partículas tocando a borda se "Excluir borda máxima" estiver selecionado. "Exclude Edge Maxima" aplica-se ao máximo, não à partícula.

Encontre o Maxima não funciona em pilhas, mas a macro FindStackMaxima o executa em todas as imagens de uma pilha e cria uma segunda pilha contendo as imagens de saída. A macro FindMaximaRoiManager demonstra como adicionar partículas encontradas pelo Find Maxima ao ROI Manager.

Melhore o contraste.

Esse comando não altera os valores de pixel, desde que as opções Normalizar e Igualar histograma não estejam ativadas.

Os pixels saturados determinam o número de pixels na imagem que podem ficar saturados. Aumentar esse valor aumenta o contraste. Esse valor deve ser maior que zero para impedir que alguns pixels periféricos façam com que o alongamento do histograma não funcione como pretendido.

Verifique Normalize e ImageJ irá recalcular os valores de pixel da imagem de modo que o intervalo seja igual ao intervalo máximo para o tipo de dados, ou 0-1.0 para imagens flutuantes. O intervalo máximo é de 0-255 para imagens de 8 bits e 0-65535 para imagens de 16 bits. Observe que a normalização de imagens RGB não é suportada. A opção Utilizar histograma de pilha é ignorada.

Com pilhas, outra caixa de seleção, Processar todas as fatias, é exibida. Se esta opção estiver ativada, a normalização e a equalização do histograma serão aplicadas a todas as fatias na pilha.

Verifique Igualar o histograma para melhorar a imagem usando a equalização do histograma. Crie uma seleção e a equalização será baseada no histograma da seleção. Usa um algoritmo modificado que leva a raiz quadrada dos valores do histograma. Mantenha a tecla alt pressionada para usar o algoritmo de equalização de histograma padrão. As opções de pixels saturados e de normalização são ignoradas quando Equalizar o histograma está marcado. O código de equalização foi contribuído por Richard Kirk.

Se Histograma de pilha for selecionado, o ImageJ usará o histograma geral da pilha em vez de histogramas de fatia individuais, que permitem ajustes ideais somente para cada fatia. Essa opção pode ser especialmente relevante ao executar aprimoramentos com base em um ROI.

Submenu Ruído.

Adicionar mais ruído.

Sal e pimenta.

Remover Outliers.

Raio determina a área usada para calcular a mediana (não calibrada, ou seja, em pixels). Veja Processar & gt; Filtros & gt; Mostrar máscaras circulares para ver como o raio se traduz em uma área. O limiar determina o quanto o pixel deve desviar da mediana para ser substituído, em unidades brutas (não calibradas). Quais outliers determinam se os pixels mais claros ou mais escuros do que o ambiente (a mediana) devem ser substituídos.

Remova NaNs.

Raio determina a área do núcleo circular usado para calcular a mediana. A macro NaNs demonstra como criar, contar e remover NaNs. Observe que alguns filtros ImageJ, como Gaussian Blur, Mean e Variance, destroem o contorno do pixel NaN configurando-o também para NaN. Outros filtros podem produzir resultados inválidos na posição dos pixels NaN.

Submenu Sombras.

Submenu Binário.

Faça binário.

Com pilhas, todas as imagens na pilha são convertidas em binário usando o limite calculado da fatia atualmente exibida. Use a macro ConvertStackToBinary para converter uma pilha em binário usando limites calculados localmente. A macro MakeSliceBinary converte a fatia de pilha atual em binário e avança para o próximo quando você pressiona uma tecla.

Converta em Máscara.

Iterações especifica o número de vezes que erosão, dilatação, abertura e fechamento são realizadas.

Contagem especifica o número de pixels de fundo adjacentes necessários antes que um pixel seja removido da borda de um objeto durante a erosão e o número de pixels de primeiro plano adjacentes necessários antes que um pixel seja adicionado à borda de um objeto durante a dilatação.

Verifique o fundo preto se a imagem tiver objetos brancos em um fundo preto. Plugins podem definir esta opção usando e macros podem configurá-lo usando onde b é 'verdadeiro' ou 'falso'.

Se a opção Bordas do bloco quando a erosão estiver marcada, Processar> Binário & gt; Erode não será erodido a partir das bordas da imagem. Essa configuração também afeta Processar & gt; Binário & gt; Fechar, que é eliminado das bordas, a menos que essa caixa de seleção esteja marcada.

A saída de EDM determina o tipo de saída para os comandos Processar & gt; Binário & gt; Distância do mapa, Pontos finais e Voronoi. Defina para "Sobrescrever" para saída de 8 bits que sobrescreve a imagem de entrada; "8 bits", "16 bits" ou "32 bits" para imagens de saída separadas. Saída de 32 bits tem resolução de distância de ponto flutuante (subpixel).

Esqueletizar.

Mapa de distância.

Pontos finais.

Ativar a depuração em Editar & gt; Opções & gt; Misc e o comando Bacias criam uma animação que mostra como o algoritmo de bacias hidrográficas funciona. Um exemplo está disponível.

Na saída, o valor dentro das células de Voronoi é zero; os valores de pixel das linhas divisórias entre as células são iguais à distância das duas partículas mais próximas. Isso é semelhante a uma transformação do eixo medial do plano de fundo, mas não há linhas nos orifícios internos das partículas. Escolha o tipo de saída ("Sobrescrever", "8 bits", "16 bits" ou "32 bits") na caixa de diálogo Processar> Binário & gt; Opções.

Submenu de Matemática.

Recíproca.

Fundo NaN.

Macro (avaliador de expressões)

Submenu FFT.

Se o mouse estiver sobre uma janela de domínio de frequência ativo (FFT), sua localização será exibida em coordenadas polares. O ângulo é expresso em graus, enquanto o raio é expresso em pixels por ciclo (p / c). O raio é expresso em [unidades] por ciclo (por exemplo, mm / c) se a escala espacial da imagem for definida usando Analyse & gt; Set Scale. Com v1.39b ou posterior, as coordenadas polares das seleções de pontos são registradas por Analisar & gt; Medir. Um exemplo está disponível.

FFT inversa.

Observe que as áreas a serem filtradas na imagem do domínio da frequência devem ser preenchidas com zero e as áreas a serem passadas devem ser preenchidas com 255. É possível verificar se esse é o caso movendo o cursor sobre uma área preenchida e observando que os valores exibidos na barra de status são 0 ou 255.

Este exemplo ilustra como criar máscaras que removem ou transmitem as baixas freqüências de uma imagem.

Com seleções descentralizadas, a mesma frequência espacial aparece duas vezes no espectro de potência, em pontos opostos ao centro. Com o ImageJ 1.41k e posterior, basta preencher / limpar apenas um deles. No exemplo a seguir (cortesia de Arlo Reeves), as seleções limpas na metade superior do espectro de potência foram automaticamente espelhadas para a metade inferior, conforme mostrado no espectro de potência da imagem filtrada.

A imagem usada neste exemplo está disponível em rsb. info. nih. gov/ij/images/abe. tif. Há também um exemplo que demonstra como remover o ruído de imagens geradas por um microscópio confocal de varredura a laser.

Redisplay Power Spectrum.

Opções FFT.

Display - Estas são caixas de seleção que especificam quais imagens são criadas pelo comando FFT: FFT Window é a saída padrão. Consiste em uma imagem de 8 bits do espectro de energia e dos dados reais, que permanecem invisíveis para o usuário. A imagem do espectro de energia é exibida com escala logarítmica, aumentando a visibilidade de componentes que são pouco visíveis. Os dados reais são usados ​​para o comando Inverse FFT. O Raw Power Spectrum é o espectro de energia sem escala logarítmica. Fast Hartley Transform é o formato interno usado pelo comando, que é baseado em uma transformação de Hartley em vez de uma transformação de Fourier. A Transformada Complexa de Fourier é uma pilha com duas fatias para as partes real e imaginária da FFT. Check Do Forward Transform e a imagem atual é transformada imediatamente ao fechar a caixa de diálogo Opções FFT.

Filtro de passagem ..

Filtrar estruturas grandes Até - variações suaves da imagem com tamanhos típicos de manchas claras ou escuras maiores que esse valor são suprimidas (fundo).

Filtrar pequenas estruturas até - determina a quantidade de suavização. Objetos na imagem menores que esse tamanho são fortemente atenuados. Observe que esses valores são metade das freqüências espaciais do corte real. O corte é muito suave, então o passa-banda atenua notavelmente as freqüências espaciais no centro do passa banda a menos que a diferença dos dois valores seja grande (digamos, mais do que um fator de 5 ou mais).

Suprimir listras - selecione se deseja eliminar faixas horizontais ou verticais. A remoção de faixas horizontais é semelhante à subtração de uma imagem que é apenas desfocada na direção horizontal do original.

Tolerância de direção - isto é para suprimir listras; valores mais altos removem faixas e / ou listras mais curtas que estão sendo executadas sob um ângulo em relação à direção horizontal (vertical).

Autoscale After Filtering coloca a intensidade mais baixa em 0 e a intensidade mais alta em 255, preservando todas as intensidades.

Saturação permite que algumas intensidades entrem na saturação e produza um melhor contraste visual. Saturação só tem efeito quando a Autoscale está ativada.

Filtro de exibição mostra o filtro gerado. Observe que isso desativa a opção Desfazer da operação de filtro na imagem original. O filtro de passagem de banda usa um algoritmo especial para reduzir os artefatos de borda (antes da transformação de Fourier, a imagem é ampliada anexando cópias espelhadas de partes da imagem fora da imagem original, não ocorrendo saltos nas bordas).

Filtro customizado..

Submenu Filtros.

Linhas na área de texto devem todas ter o mesmo número de coeficientes, as linhas devem ser terminadas com um retorno de carro e os coeficientes devem ser separados por um ou mais espaços. Os kernels podem ser colados na área de texto usando o atalho de teclado ctrl + v. A verificação Normalize Kernel faz com que cada coeficiente seja dividido pela soma dos coeficientes, preservando o brilho da imagem.

O kernel mostrado é um 9 x 9 "mexicano chapéu", que faz tanto suavização e detecção de borda em uma operação. Observe que os kernels podem ser salvos como um arquivo de texto clicando no botão "Salvar", exibido como uma imagem usando Arquivo> Importar & gt; Imagem de texto, dimensionado para um tamanho razoável usando Imagem & gt; Ajustar & Gt; Tamanho e plotado usando Analisar & gt;

A macro ConvolutionDemo demonstra como usar esse comando em uma macro.

Desfoque Gaussiano.

61%, ou seja, o desvio padrão sigma do Gaussian (isso é o mesmo que no Photoshop, mas diferente das versões anteriores do ImageJ, onde um valor de 2,5 vezes mais tinha que ser inserido.

Como todas as operações de convolução do ImageJ, assume que os pixels fora da imagem têm um valor igual ao pixel da borda mais próxima. Isso dá maior peso aos pixels de borda do que os pixels dentro da imagem e maior peso aos pixels de canto do que os pixels sem canto na borda. Assim, ao suavizar com raio de tremido muito alto, a saída será dominada pelos pixels da borda e especialmente pelos pixels do canto (no caso extremo, com um raio de desfoque de, por exemplo, 1e20, a imagem será deslocada pela média dos quatro cantos) píxeis).

Para maior velocidade, com exceção de pequenos raios de desfoque, as linhas (linhas ou colunas da imagem) são reduzidas em escala antes da convolução e aumentadas para o comprimento original posteriormente.

Máscara Não Afiada.

Mostrar máscaras circulares.

Calculadora de imagem.

Você pode selecionar um dos 12 operadores no menu pop-up Operação :. Marque Criar nova janela e uma nova imagem ou pilha será criada para conter o resultado. Caso contrário, o resultado da operação substitui alguns ou todos de Image1. Marque "Resultado de 32 bits" e as imagens de origem serão convertidas em ponto flutuante de 32 bits antes que a operação especificada seja executada.

Com imagens de 32 bits (flutuantes), os pixels resultantes da divisão por zero são definidos como Infinito ou NaN (Não é um Número) se um pixel zero é dividido por zero. O valor de divisão por zero pode ser redefinido em Editar & gt; Opções & gt; Misc.

Análise de Partículas.

A contagem automática de partículas pode ser feita se a imagem não tiver muitas partículas individuais se tocando. A contagem manual de partículas pode ser feita usando a ferramenta Multi-point.

A segmentação, ou a capacidade de distinguir um objeto de seu histórico, pode ser uma questão difícil de lidar. Depois disso, o objeto pode ser analisado.

Bacia Hidrográfica do limiar RAW “AnalyzeParticles”

Definindo um limite.

5.1.1.1 Limiar manual.

A análise automática de partículas requer uma imagem “binária”, preto e branca. Um intervalo de limite é definido para informar os objetos de interesse além do plano de fundo. Todos os pixels da imagem cujos valores estão abaixo do limite são convertidos em preto e todos os pixels com valores acima do limite são convertidos em branco ou vice-versa.

Existem muitos algoritmos que você pode usar para calcular o limite sem introduzir viés de usuário. Uma avaliação de mais de 40 deles pode ser encontrada neste documento:

Sezgin, M. & amp; Sankur, B. (2004), "Pesquisa sobre técnicas de limiarização de imagem e avaliação quantitativa de desempenho.", Journal of Electronic imaging 13 (1): 146-168 (no Google Scholar).

Fiji tem vários plugins encontrados no menu Image ▶ Adjust ▶ Threshold para o cálculo automático de um limiar de imagem. Estes incluem o limiar de Otsu, o limiar de entropia máxima e o limiar de modelagem de mistura. Para obter uma lista completa dos métodos disponíveis no Fiji, consulte a seção Plug-ins localizada na seção Documentação, na guia Conteúdo, na parte superior desta página.

Separação de bacias hidrográficas.

A sobreposição de objetos em uma imagem binária pode ser separada usando o comando de menu Process ▶ Binary ▶ Watershed.

Primeiro converta a imagem para binário por limiar. Os pixels pretos são então substituídos por pixels cinzas de intensidade proporcional à sua distância de um pixel branco. Os pixels pretos mais próximos da borda são mais claros que os pixels pretos mais centrais. Este é o mapa de distância euclidiano (EDM) da área preta. A partir disso, os centros dos objetos são calculados. Esses são os pontos finais erodidos (UEPs) de cada área preta, o que significa que eles são equidistantes de cada borda. Esses pontos são então dilatados até tocarem outro pixel preto. Este ponto de encontro é onde uma linha divisória é desenhada.

Analise Partículas.

Defina o tamanho mínimo e o tamanho máximo da área de pixels para excluir qualquer coisa que não seja um objeto de interesse na imagem. Os valores de arredondamento entre 0,0 e 1,0 também podem ser selecionados para ajudar a excluir objetos indesejados. Selecione a opção Mostrar: Contornos para exibir uma imagem dos objetos detectados. O menu suspenso Mostrar também permite que o usuário mostre Nada, Contornos Nus, Elipses, Máscaras, Contagem de Máscaras, Contornos de Sobreposição e Máscaras de Sobreposição. O usuário pode optar por Exibir resultados, Limpar resultados, Resumir, Adicionar ao gerente, Excluir em arestas, Incluir furos, Gravar inícios e / ou Mostrar in situ.

A análise de partículas pode ser automatizada por meio de plugins ou macros quando o valor limite correto e o intervalo de tamanho de partícula forem determinados para seus objetos de interesse.

Contador do Núcleo.

Este plugin automatiza muitas das etapas discutidas acima.

Digite o intervalo de tamanho a ser contado.

Outras opções podem ser facilmente adicionadas a pedido.

A contagem, a área e o tamanho médio são retornados como uma janela de texto e as partículas delineadas são sobrepostas em uma duplicata da imagem original.

Você pode usar a ferramenta multiponto incorporada para contar manualmente as partículas.

Particle Tracker Particle Tracker é um plugin de rastreamento de pontos 2D para detecção automatizada e análise de trajetórias de partículas, conforme registrado por imagens de vídeo em biologia celular. O algoritmo é descrito em Sbalzarini e Koumoutsakos (2005 [1]).

TrackMate Use o comando de menu Plugins ▶ Tracking ▶ TrackMate. Este plugin permite que você execute o rastreamento de partículas individuais de estruturas pontuais. Para mais informações detalhadas, consulte o tutorial e a explicação do TrackMate.

Acompanhamento manual Use o comando de menu Plugins ▶ Tracking ▶ Manual Tracking. Esta ferramenta permite que você acompanhe o movimento de uma célula.

Função de Distribuição Radial.

O básico.

A macro é baseada no cálculo da autocorrelação por meio da transformada de Fourier, mas não assume condições de contorno periódicas. Aumenta o tamanho da imagem para um valor grande o suficiente para evitar qualquer influência do & ldquo; periódico & rdquo; natureza da FFT e corrige os efeitos de tamanho finito (efeitos de borda) que ocorreriam porque as partículas próximas à borda têm necessariamente menos vizinhos distantes do que as partículas próximas ao centro (essa correção é exata apenas no caso de partículas muito pequenas; precisão para partículas grandes).

Para a autocorrelação da imagem (todos os pixels, não apenas os centros), consulte a macro Autocorrelação da Média Radial.

Instalação rápida.

Usando a macro.

Atuação.

Para uma imagem 2048 * 2048 (expandida para 4096 * 4096 internamente), o tempo de processamento é de cerca de meio minuto em um Core2Duo de 2,4 GHz; requisito de memória de cerca de 400 MB.

Problemas conhecidos.

Mais exemplos.

Alterações no código de macro são relatadas aqui. Para ver as alterações na wiki, use a guia "Revisões antigas" acima.

2008-dez-09 Michael Schmid - primeira versão.

2009-May-14 Michael Schmid - “selecione nenhum”, comentários mais específicos.

2011-Ago-19 Ajay Gopal - muitas correções de bugs relacionadas à pilha.

2011-Ago-21 Ajay Gopal - várias mudanças na interface do usuário.

2011-Ago-22 Ajay Gopal - movido changelog de macro para wiki para reduzir o inchaço do cabeçalho.

Análise Sholl.

Sholl automatizado e multithreaded para análise direta de imagens fluorescentes e morfologias rastreadas. Possui quantificações poderosas com base no ajuste de curva. A análise de dados obtidos fora do ImageJ também é possível.

A técnica de Sholl [2] é usada para descrever os mandris neuronais. Este plugin pode executar o Sholl diretamente em imagens 2D e 3D em escala de cinza de neurônios isolados. Seu algoritmo interno para coletar dados é baseado em como a análise de Sholl é feita à mão - ele cria uma série de conchas concêntricas (círculos ou esferas) em torno do foco de um mandril neuronal e conta quantas vezes voxels conectados definindo o mandril se cruzam com a amostragem cartuchos. As principais vantagens deste plugin sobre outras implementações são:

Ao analisar as imagens diretamente, não é necessário o rastreamento anterior do mandril (embora também possa analisar mandris rastreados). Ele combina ajuste de curva com diversos métodos para recuperar automaticamente descritores quantitativos dos dados amostrados, o que permite comparações estatísticas diretas entre os mandris. amostragem repetida em torno de focos definidos pelo usuário Permite o processamento em lote.

O plugin é distribuído com Fiji. Ele instala vários comandos em Analysis ▷ Sholl ▷. Como parte de um esforço ativo para modernizar o ImageJ, você precisa se inscrever no site de atualização do Java 8 para acessar a versão mais recente do plug-in (isso também permitirá que você acesse os recursos mais recentes do ImageJ). Para fazer isso, você pode:

Baixe o último lançamento de Fiji. Lançamentos mais recentes vêm pré-empacotados com o Java 8 e já estão inscritos no site de atualização do Java-8. Se você baixou o Fiji há algum tempo e quer manter sua instalação existente, você terá que baixar o Java 8 e tornar sua instalação Fiji ciente disso. Em seguida, inscreva-se no site de atualização do Java-8.

Neste modo (análise de bitmap), o plugin requer uma imagem binária ou uma imagem em escala de cinza segmentada (2D ou 3D) contendo um único neurônio.

Segmente o arbor neuronal usando Image ▷ Adjust ▷ Threshold. (atalho: ⇧ Shift + T). N. B .: Ao usar imagens multicanais, você terá que configurar o modo de exibição para Escala de cinza usando a Ferramenta de canais Imagem ▷ Cor ▷. (⇧ Shift + Z), porque as imagens exibidas como Composites não podem ser limitadas. Defina o centro de análise usando um ROI de inicialização válido. Executar Análise ▷ Sholl ▷ Sholl Analysis. , ajustando os parâmetros padrão no prompt de diálogo. Pressione Mais »Cf. Segmentação para inspecionar visualmente as duas fases limitadas: arbor e background. Problemas? Leia as perguntas frequentes.

ROI de inicialização.

O centro de análise pode ser especificado usando uma das três possibilidades:

Linha reta A Linha reta desde o foco do caramanchão até seu ponto mais distal usando a ferramenta Linha reta. As vantagens de usar seleções de linha são duplas: 1) O centro de análise e o raio final são definidos automaticamente e 2) Linhas horizontais / verticais (criadas ao pressionar ⇧ Shift enquanto utiliza a Ferramenta de Seleção de Linha Reta) podem ser usadas para restringir a análise - regiões da imagem. Ponto único Um único ponto que marca o foco do caramanchão usando a Ferramenta de Seleção de Ponto. Com seleções de ponto único, somente o centro de análise é definido. Assim, esta opção é adequada para processamento em lote de imagens com diferentes dimensões com raio de finalização indefinido. Selecção multiponto A Selecção multi-ponto (contador multiponto) em que o primeiro ponto marca o centro de análise, enquanto os restantes pontos marcam (contabilizam) o número de ramificações primárias necessárias para o cálculo dos índices de ramificação). Adequado para casos em que a inferência do raio de partida não é efetiva.

Cf. Segmentação

Pressione Mais »Cf. Segmentação para confirmar visualmente qual fase da imagem segmentada será amostrada. Este comando realça o primeiro plano dos pixels de fundo e é particularmente útil ao analisar imagens em preto e branco (binárias) ou ao usar a tabela de pesquisa B & W no widget Threshold (Image ▷ Adjust ▷ Threshold. ⇧ Shift + T). Cf. A segmentação permite garantir que você está medindo os processos neuronais e não os espaços intersticiais entre eles. Aqui está um exemplo usando um mandril axonal de um neurônio olfativo de Drosophila do conjunto de dados DIADEM [3]:

Observe a reversão do Cf. A saída de segmentação e como a máscara de interseções não decora mais os processos axonais, mas os espaços intersticiais entre eles. As conseqüências da inversão de fase são duplas: 1) o programa sobrescreve (veja rampas de matiz na parte superior esquerda da máscara de interseções) e 2) o programa detecta artefatos induzidos pelas bordas da imagem (cf. superior direita e inferior direita) cantos de máscara onde as interseções são amostradas na ausência de axônios reais nesses locais). Além disso, observe que a imagem inicial em preto e branco seria a mesma em uma tabela de pesquisa invertida (Imagem ▷ Tabelas de pesquisa ▷ Inverter LUT).

Esse recurso é processado pela Análise ▷ Sholl ▷ Análise de Sholl (Perfil Existente). . Este comando pode ser usado para re-analisar dados (replanejar, modificar opções de ajustes, etc.) sem ter que acessar a imagem inicial ou rastrear dados. Processamento em lote também é possível. Digno de nota:

Dados de entrada: Qualquer guia ou arquivo de texto delimitado por vírgula (.csv,.txt,.xls,.ods) pode ser usado. Você pode arrastar & amp; Solte esses arquivos na janela principal do ImageJ, importe os dados da área de transferência ou use os dados de qualquer outra tabela já aberta pelo ImageJ. Restringindo dados de entrada: Para restringir as medidas a um intervalo de distâncias (consulte o exemplo relacionado), selecione o intervalo de distâncias que você deseja analisar. Você pode clicar na primeira linha do intervalo e, em seguida, arrastar o mouse até a última linha ou pressionar ⇧ Shift enquanto seleciona a última linha do intervalo. Em seguida, no prompt, ative a caixa de seleção Restringir análise somente às linhas selecionadas. Cálculo do tamanho do passo do raio: O tamanho do passo do raio é calculado a partir da diferença entre as duas primeiras linhas da coluna Distância. Isto é principalmente relevante ao escolher o shell anular / esférico como normalizador.

A maioria dos parâmetros é compartilhada por todos os comandos Analysis no submenu Analysis ▷ Sholl.. No entanto, algumas configurações são específicas para o tipo de dados usados ​​como entrada: Uma imagem segmentada, um traçado ou um perfil obtido anteriormente. Ao analisar imagens, os valores de entrada levam em conta as informações de escala da imagem (que podem ser definidas usando Analisar ▷ Escala de Conjunto. Ou Imagem ▷ Propriedades. (⇧ Shift + P), o tipo de imagem (2D ou 3D) e seu ROI ativo.

Definição de Conchas.

Raio de partida O raio do menor círculo / esfera de amostragem, ou seja, a primeira distância a ser amostrada. Raio final O raio do maior (último) círculo / esfera de amostragem. Ele é calculado automaticamente se um ROI de linha é usado. Observe que a distância especificada pode não ser realmente amostrada, se o tamanho da etapa do raio não for um divisor do raio final - Raio inicial. Neste caso, o programa escolherá a maior distância possível menor que o valor especificado.

N. B. Você pode limpar o raio final ou configurá-lo para NaN ("Not a Number") para obter uma amostra da imagem inteira. Isso é particularmente útil quando o processamento em lote de imagens com dimensões diferentes.

Tamanho do raio do intervalo O intervalo de amostragem entre raios de círculos / esferas de amostragem consecutivos. Este valor pode ser definido como zero para medições contínuas (incremento de 1-voxel).

N. B. Para pilhas com tamanho de voxel anisotrópico, definindo o tamanho do passo do raio como zero, define o comprimento do passo para a dimensão do voxel isotrópico correspondente, isto é, a raiz cúbica do produto das dimensões do voxel (imagens 3D) ou a raiz quadrada do produto das dimensões do pixel (imagens 2D).

Restringir a análise ao hemicírculo / hemisfério Esta opção só está disponível quando um raio ortogonal foi criado (mantendo pressionada a tecla ⇧ Shift enquanto utiliza a ferramenta de seleção de linha reta). Pode ser usado para limitar a análise aos subcompartimentos do caramanchão.

N. B. Para linhas horizontais, essa opção instrui o algoritmo a medir interseções em locais equidistantes do centro que possuem coordenadas y acima / abaixo da linha desenhada. Para linhas verticais, ele instrui o plug-in a medir interseções em locais equidistantes do centro que possuem coordenadas x à esquerda / direita da linha desenhada.

Múltiplas Amostras / Redução de Ruído.

Amostras por raio (somente imagens 2D) Define o número de medições a serem realizadas em cada circunferência de amostragem. Essas medições são então combinadas em um valor único de acordo com o método de integração escolhido. Essa estratégia, uma ruptura com as abordagens anteriores, aumenta a precisão dos perfis não contínuos ao diluir o efeito de processos que se estendem tangentes à circunferência de amostragem. Visualmente, essa opção pode ser imaginada como a "espessura" da circunferência de amostragem: por exemplo, para um raio de 100 pixels e um valor de 3 amostras por raio, o número final de interseções integraria as medidas amostradas nas distâncias 99, 100 e 101

Descritores e Ajuste de Curva.

Encerramento do raio de corte O número de interseções a serem usadas na definição do raio de fechamento. Número de ramificações primárias O número de ramificações primárias (isto é, aquelas originadas diretamente do soma celular quando o centro de análise é o pericário) a ser usado no cálculo dos índices de ramificação de Schoenen. Ele é automaticamente preenchido usando contagens multipontos se uma ROI multiponto for detectada na inicialização. Defina como zero (ou NaN) para desativar cálculos de índices de ramificação. Inferir do raio inicial Se marcada, o Número de ramificações Primárias é deduzido da contagem de interseções no raio Inicial. Ajustar perfil e computar descritores Se marcado, os dados são ajustados de acordo com o método escolhido e métricas apropriadas calculadas automaticamente. Se desmarcada, somente os dados amostrados são plotados. Mostrar detalhes do acessório Selecione esta opção para que todos os parâmetros do acessório simplex sejam impressos na janela Log. O coeficiente de determinação (R ​​2, uma medida de qualidade de ajuste) é sempre armazenado na tabela Resultados da Sholl, mesmo quando essa opção não está selecionada.

Escolha dos Métodos.

O tipo de perfil (s) a ser obtido. Linear (perfil sem normalização) ou perfis normalizados: Norma linear, Semi-log ou log-log.

Polinomial Especifica o grau do polinômio a ser ajustado ao perfil Linear [4]. Enquanto o polinômio de melhor aproximação, ou "melhor ajuste", deve ser empiricamente determinado para cada tipo de célula analisada, é possível pedir ao plugin que preveja a ordem do polinômio de ajuste (ou pelo menos tente) usando a opção Melhor grau de adaptação. . Nesse caso, o plug-in percorrerá todas as opções disponíveis de polinômios, executará cada ajuste em segundo plano e escolherá aquele com o maior coeficiente de determinação. Mais informativo Selecione essa opção quando você não puder prever qual tipo de perfil normalizado melhor descreve o conjunto de dados. Se escolhido, o plugin usará a taxa de determinação para determinar qual dos métodos Semi-log ou log-log é mais apropriado. A norma linear não é executada.

O melhor grau de adaptação e as escolhas mais informativas são obviamente mais intensivas no computador e podem ser monitoradas ativando a caixa de seleção Mostrar detalhes da instalação. Normalizador A propriedade do shell de amostragem a ser usada na normalização dos perfis de norma linear, semi-log e log-log. É descrito abaixo.

Opções de saída.

Criar máscara de interseções Se marcada, é gerada uma projeção de intensidade máxima de 16/32-bit da imagem analisada na qual o caramanchão medido é pintado de acordo com seu perfil Sholl. O tipo de dados (Bruto, ou seja, amostrado ou Ajustado) é exibido no subtítulo da imagem e pode ser especificado em Análise ▷ Sholl ▷ Métricas & amp; Opções ou usando as Opções. comando no menu suspenso Mais ».

NB: A Tabela de Consulta (LUT) padrão usada pela máscara pode ser alterada usando a Imagem ▷ Tabelas de Pesquisa. A cor de fundo [nível de cinza: 0 (preto) a 255 (branco)] também pode ser definida em Métricas & amp; Opções , ou em qualquer momento posterior usando Imagem ▷ Cor ▷ Editar Lut. As versões WYSIWYG (imagens RGB) dessas máscaras podem ser obtidas pressionando ⇧ Shift + F (Imagem ▷ Sobreposição ▷ Nivelar) ou executando Analisar ▷ Ferramentas ▷ Barra de Calibração. Amostras de sobreposição de amostras e pontos de interseção (somente imagens 2D) Se marcada, dois conjuntos de ROIS são adicionados à sobreposição de imagem: 1) conchas concêntricas que correspondem às distâncias amostradas (ROIs circulares ou ROIs compostas ao usar hemicírculos); e 2) ROIs multiponto nos locais de interseção entre as conchas e os clusters de pixels em primeiro plano. Salvar resultados para Se marcado, todos os resultados (com exceção da Tabela Sholl) são salvos no diretório especificado. Eles incluem: 1) Sholl plots (salvos como imagens PNG), 2) Uma tabela contendo dados detalhados e 3) A máscara Sholl. Os arquivos são nomeados de acordo com o nome do arquivo da imagem e o método de análise. As opções de salvamento podem ser especificadas em Analysis ▷ Sholl ▷ Metrics & amp; Opções (Opções. Comando no menu suspenso Mais »). Não exibir arquivos salvos Se marcada, os arquivos salvos são salvos diretamente no disco e não são exibidos. Ative esta opção quando arquivos de processamento em lote.

Perfis Linear, Linear-norma, Semi-log e Log-log para a célula ddaC (Arquivo ▷ Amostras Abertas ▷ ddaC Neuron), versão 3.0. A maioria das métricas recuperadas é destacada automaticamente pelo plug-in. Perfil linear: Valor médio (linha de grade horizontal) e Centróide (marca colorida). Perfis logarítmicos: O coeficiente de regressão de Sholl (também conhecido como decaimento de Sholl) pode ser recuperado por regressão linear usando o intervalo total de dados (linha azul) ou os dados entre os percentis 10 a 90 (linha vermelha). For this particular cell type, the Semi-log method is more informative when compared to the Log-log method.

Outputs a N vs Distance profile. Data is fitted to a polynomial function [4] . Critical radius, Critical value and Mean value of function are calculated.

Outputs a N/S vs Distance profile. Points are fitted to a power function. It is an intermediate representation of the data that can be used to gauge the choice of normalizer. Once plotted under a logarithmic scale the Linear-norm curve is similar to the Semi-log profile.

Outputs a log(N/S) vs Distance profile. A linear regression is fitted to the sampled data. The Sholl regression coefficient ( k ) is calculated.

Outputs a log(N/S) vs log(Distance) profile. Data is also fitted to a straight line. This is an alternative approach [5] of obtaining a relevant regression coefficient, when the Semi-log method returns a poor fit.

N For 2D images, the N umber of clusters of pixels (8–connected) intersecting the circumference of radius r.

For 3D images, the N umber of clusters of voxels (26-connected) intersecting the surface of the sphere of radius r.

r Distance from center of analysis ( r adius of Sholl circle/sphere)

log Natural logarithm, the logarithm to the base e.

S The chosen property of the sampling shell to be used in the normalization of Linear-norm , Semi-log , and Log-log profiles.

For 2D images, the Perimeter of the sampling circumference (2πr) or the Area of the corresponding circle (πr 2 )

For 3D images, the Surface of the sampling sphere (4πr 2 ) or its respective Volume (4/3πr 3 )

N. B. A third normalization option is also available when performing non-continuous sampling: Annulus / Spherical shell . In this case, the normalization is performed against the area of the annulus formed between the circumferences at r ± Radius step size /2 (2D images), or against the volume between the two spheres at r ± Radius step size /2 (3D images).

Morphometric descriptors and other properties of the arbor are printed to a dedicated table named Sholl Results . Output is fully customizable using Analysis ▷ Sholl ▷ Metrics & Opções or using the Options. command in the More» drop-down menu. The first columns log analysis parameters: Image Directory , filename and voxel unit , Channel , Lower and Upper Threshold levels , X, Y (in pixels) and Z (slice number) coordinates of center of analysis, Starting and Ending radius , Radius step , Number of Samples per Radius , etc. Other parameters are described below.

Metrics based on sampled data.

Radius of highest count of intersections ( Max inters. radius ) The distance at which the Highest count of intersections occurred, reflecting sites of highest branch density. Note that if the same maximum occurs multiple times, only the first distance is considered. See also Critical radius Schoenen Ramification index ( Ramification index (sampled) ) A measure of ramification [6] : the ratio between Max inters. and the number of primary branches. It is only calculated when primary branches is valid and not zero. See also Ramification index (fit) Centroid radius The abcissa of the centroid (i. e., the geometric center or barycenter) of the linear profile. It is highlighted on the N vs Distance plot. Centroid value The ordinate of the centroid (i. e., the geometric center or barycenter) of the linear profile. It is highlighted on the N vs Distance plot. Enclosing radius The last (thus, the widest) of Intersecting radii to be associated with the number of intersections specified by Enclosing radius cutoff. For a cutoff of 1 (the default) Enclosing radius is the widest of Intersecting radii . It reflects the Feret length of the arbor.

Metrics based on fitted data.

Mean value The mean value [4] of the fitted polynomial function (1), representing the average of intersections over the whole area occupied by the arbor. Abbreviation N av . On the Sholl plot, it is highlighted as the height of the rectangle that has the width of Enclosing radius − First intersecting radius and the same area of the area under the fitted curve on that discrete interval. It is analogous to Mean inters., the arithmetic mean of sampled intersections throughout the arbor (cf. Metrics based on sampled data). By default (see Advanced Usage), it is calculated with a precision of 1/1000 of Radius step size . Schoenen Ramification index ( Ramification index (fit) ) Schoenen Ramification index retrieved from fitted profile: The ration between Critical value and Number of primary branches. See also Ramification index (sampled) Skewness ( Skewness (fit) ) The skewness of the fitted polynomial distribution between Starting radius and Ending radius. Kurtosis ( Kurtosis (fit) ) The kurtosis of the fitted polynomial distribution between Starting radius and Ending radius. Polynomial R 2 ( Polyn. R^2 ) The coefficient of determination of the polynomial fit described in (1).

Sholl Analysis tries to be as flexible as possible by providing several options for normalization and curve fitting. However, it cannot offer exhaustive curve fitting options as determining best fit models requires reasonable choices that are not amenable to full automation. For this reason, complementary tools for curve fitting can be installed as needed using BAR by subscribing to its update site. Several BAR commands complement Sholl Analysis . Esses incluem:

Segmentation tools Thresholding, shape-based masking and edge-detection routines (see full BAR list) Data analysis tools Find Peaks: Retrieves local maxima under several filtering options such as peak amplitude, peak height and peak width. Can be used to retrieve secondary sites of branch density Fit Polynomial: Fits a polynomial of any degree to sampled data. Features an heuristic algorithm for guessing a polynomial "best fit". Expands the built-in repertoire of polynomial fits up to 50 th order functions. Create Boxplot: Allows direct comparison of metrics between groups or sets of data (specially useful when tagging images with the Comment field in Analysis ▷ Sholl ▷ Metrics & Options. ) Interactive Plotting: Whole-purpose routine that plots data from imported spreadsheets.

This section discusses some aspects that should be taken into account when segmenting neuronal arbors to be processed by Sholl Analysis . Since image segmentation (i. e., the partitioning of images into analyzable parts) is vulnerable to noise and background fluorescence, it is not possible to generalize universal routines that efficiently binarize grayscale images. This means that any procedure that tries to appropriately describe the original fluorescence image with a binary mask must be tailored to the characteristics of individual datasets. As mentioned in Complementary Tools, several routines listed here as distributed through the BAR update site.

Noise Noise can be mitigated through the usage of processing filters, specially edge-preserving ones. Examples: Rolling Ball or "Top hat" filters, e. g., Process▷ Subtract Background. Median Filtering (2D/3D), e. g., Process▷ Filters▷ , Plugins▷ 3D▷ Anisotropic Diffusion, Plugins▷ Process▷ Anisotropic Diffusion 2D Sobel Edge Detection, e. g., Process▷ Find Edges Shen-Castan Edge Detector (BARupdate site), BAR▷ Segmentation▷ Frequency filters, e. g., Process▷ FFT▷ Bandpass Filter.

Uneven Illumination Uneven illumination problems, typically associated with wide field microscopy, do occur in confocal microscopy when signal from deep layers of the tissue is not captured as bright as with superficial layers. This signal attenuation along the Z-axis will generate a shaded gradient across the stack that histogram-based segmentation will need to take into account. While these problems are better tackled during acquisition (e. g., using laser ramping), it is possible to mitigate this effect using histogram-normalization techniques. Examples: Bleach Correction, Image▷ Adjust▷ Attenuation correction.

Automated Segmentation It is possible to adopt more sophisticated segmentation algorithms when global thresholding methods do not yield satisfactory results. Examples: Local Threshold, Image▷ Adjust▷ Robust Automatic Threshold Selection, Plugins▷ Segmentation▷ Level Sets, Plugins▷ Segmentation▷ Morphological Segmentation (IJPB-plugins update site), Plugins▷ Segmentation▷ Squassh, split-Bregman Image Segmentation (Segmentation and Quantification of Sub-cellular Shapes, MOSAIC ToolSuite update site), , Plugins▷ Mosaic▷ Segmentation▷

Semi-Automated Segmentation Object detection and image segmentation in images with poor signal-to-noise will likely require decisions taken by a human operator. This is frequently done using hand-crafted workflows using either ImageJ's built-in tools or external add ons. Examples: Blow/Lasso Tool, Plugins▷ Segmentation▷ Scripts from the BARupdate site, BAR▷ Segmentation▷

It is fairly simple to automate the analysis of multiple images using any of the scripting languages supported by ImageJ and Fiji (ImageJ Macro Language, Beanshell, Javascript, JRuby, Jython, Clojure, . ). This section provides some examples.

Batch Analysis of Images.

Any macro or script must allow the Sholl Analysis plugin to access the ROI marking the center of analysis. One could instruct ImageJ to read the coordinates of pre-existing ROIs from a text file, store a list of line selections in the ROI Manager, or write a morphology-based routine that detects the center of the arbor. However, marking the center of analysis is probably something that you will want to do manually. Here is a workflow:

Place all the. tif images to be processed in a single folder. Select the Point Selection Tool in the main ImageJ window. With 3D images, make sure Set stack positions is active in the Image▷ Overlay▷ Overlay Options. prompt. Open the first image and press ⇧ Shift + T to activate the Threshold widget ( Image▷ Adjust▷ Threshold. ). Adjust threshold levels. Press the Apply button of the Threshold widget to create a binary image. Select the z-slice containing the center of analysis. Click over the center with the Point Selection Tool and press B (shortcut for Image▷ Overlay▷ Add Selection. ). This will add the point ROI to the image overlay. Save the image as. TIFF by pressing S ( File▷ Save As. ▷ Tiff. ). Repeat the last 2 steps until all images are marked, using ⇧ Shift + O (shortcut for File▷ Open Next ) to iterate through all the images.

Now that all the images are marked, we just need to ask ImageJ to generate some lines of code. We will open the Macro Recorder ( Plugins▷ Macros▷ Record. ) and run Sholl Analysis on one of the images to find out how to call the plugin with suitable parameters. In this example, we will use the ImageJ macro language. The single line of code that appears in the recorder window will look something like this:

Now, we just need to assemble a working macro to be pasted in the Process▷ Batch▷ Macro. prompt:

Of course you can also automate any preceding steps. However, do not forget to ensure that the center of analysis will be available when the plugin is called:

É isso aí. Use the Macro Recorder to generate the customizations you will need before parsing the entire folder of images with Process▷ Batch▷ Macro.

Tip: As you may have noticed, ImageJ plugins are controlled by a single lowercase sentence in which arguments are separated by a space. Input fields and choice lists appear as keyword=value pairs, active checkboxes by a single keyword. Options that are not needed can be omitted. This makes it easier to generate customizable macros:

Batch Analysis of Tabular Data.

If you already have obtained profiles (either from previous runs or from traced cells) and would like to extract new metrics from such data, you can use the Analysis ▷ Sholl ▷ Sholl Analysis (Existing Profile). . Here is an example macro that runs the plugin over a folder of. csv files containing Sholl profiles produced by Simple Neurite Tracer:

Advanced options can be set through API calls. aqui estão alguns exemplos:

Reduce the number of discretization steps involved in the calculation of Nav, and Cv, Cr (IJ macro (IJM) language):

Note that the IJM built-in call("class. method") function can only pass strings to Java methods. For this reason, you have to quote the passed argument. Sholl_Analysis will then parse the string argument and interpreter its value. Note that calls made by the IJM language need to be set before running the plugin and remain in effect while ImageJ is running.

Analysis tool that 1) Merges individual Sholl profiles into a single table and 2) Obtains the average profile (with standard deviation) of a group of cells.

File ▷ Open Samples ▷ ddaC Neuron Opens a sample image of a Drosophila class IV ddaC sensory neuron in which dendrites have been previously segmented (2D arbor). Use it to get acquainted with the plugin. Run Image ▷ Show Info. (shortcut: I ) to know more about this cell type. Help ▷ About Plugins ▷ About Sholl Analysis. Retrieves information about the plugin version and provides links to several resources including its source code repository and its API documentation. It is also accessible through the More » dropdown menu.

How do I cite Sholl Analysis ? The authoritative reference for Sholl Analysis is: Ferreira T, Blackman A, Oyrer J, Jayabal A, Chung A, Watt A, Sjöström J, van Meyel D. ( 2014 ), Neuronal morphometry directly from bitmap images, Nature Methods 11(10): 982–984. The authoritative reference for Fiji: Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez JY, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A. ( 2012 ) Fiji: an open-source platform for biological-image analysis, Nature Methods 9(7): 676-682. What is the difference between Sholl Analysis and an homonymous plugin released by the Ghosh laboratory in 2005 ? The original Sholl Analysis plugin by Tom Maddock (version 1.0) was released for ImageJ 1.35 and is now deprecated, unmaintained software that behaves erratically in newer versions of ImageJ. The current implementation of Sholl Analysis inherits Tom's initial 2D algorithm, but has numerous added features to enhance its utility. Note that throughout 2012 the plugin was temporarily called Advanced Sholl Analysis . You can follow the entire history of the plugin on GitHub. Why do I need to threshold the cell? Counting intersections is really a binary procedure: a shell either intercepts a branch or it doesn't. For this reason the image must be split in two phases: arbor and background . In version 1.0, it was not mandatory to adjust threshold values prior to analysis. Why is it now? Image segmentation has always been required. In its early implementations, the program dealt solely with binary images and used the intensity at the center of the analysis to decide how to segregate objects from background. This approach was very restringent: It assumed that the pixels representing the neuron would have the same (constant!) intensity that was not to be found in the remaining background. As the program became aware of grayscale images, this "feature" had to be removed because a single intensity can no longer be used to infer which parts of the image should be analyzed. My images do not look that great . How can I treat them prior to analysis? Have a look at Pre-processing. My bitmap profiles are different from the ones obtained from tracings of the same cells. Por quê? As mentioned several times, the quality of the analysis relies on how the arbor was segmented. If you are working with grayscale images you probably need to optimize your segmentation routines. On the other hand, if you already obtained binary images make sure you are interpreting them properly. You should also confirm that Ending radius does not intersect objects in the image canvas that extend beyond the analyzed arbor. As a rule of thumb, always refer to the Sholl mask to visually inspect which regions of the image have been measured. My version is not the latest after running Help▷ Update Fiji. Por quê? Please note that from version 3.4.6 onwards, updates are available through the Java-8 update site. If you have manually installed/modified Sholl_Analysis. jar (Development build?). Run the Updater, choose Advanced Mode then View locally modified files under View Options . Type "Sholl" in the Search field, selecting Sholl_Analysis. jar from the list of files. If the Details pane indicates an available update, click on Locally modified under Status/Action and choose Install/Update . The latest release version will be available once you press Apply changes . See Installation FAQs for more details. This documentation is not that useful. How long do I have to wait until it gets improved? Around 20 seconds. This is the time it will take you to create an account on this wiki. Once you have created one, you will be able to improve this page yourself.

The plugin complains about a wrong image type. Por quê? The plugin does not parse RGB images, but will process any grayscale image (8/16-bit), including multi-channel (composite) images. This is intentional: RGB images are inflexible and images of fluorescence-labeled cells are typically non-RGB images. As explained in the ImageJ User Guide, RGB images can be converted using Image ▷ Color ▷ Channels Tool. or Image ▷ Type commands. I cannot see the hemicircle/hemisphere option. Por quê? This option is only available if an orthogonal line has been created by holding ⇧ Shift when using the Straight Line Selection Tool . See the ImageJ User Guide for the full list of key modifiers that can be used while creating straight line ROIs. With 3D and 4D images, how do I set the Z-position and of the center? The Z-position (depth) of the center of analysis is the active Z-slice of the stack. With multichannel (composite) images, the active channel also defines the C-position. Both are reported in the Sholl Results table. I cannot see the option to save the results. Por quê? The image you are trying to analyze is not saved locally. Saving it to a local directory (e. g., your Desktop or Home folder) should re-enable it. Why so many parameters? The plugin is designed for the analysis of a wide diversity of arbors and it is not biased to any particular cell type. The only way to ensure this broad applicability is to give users full control over the mathematical techniques used by the plugin to analyze sampled data.

How can I save/edit the Sholl Results table? Select the table, then choose File▷ Save As… The filename extension can be specified using the More » Options. command (see the ImageJ User Guide for details). Single cells cannot be modified from within ImageJ, but custom extensions (e. g.,.csv,.xls or. ods) will allow the table to be imported by other spreadsheet applications. Can I modify the way data is displayed? Mostly, using Analysis ▷ Sholl ▷ Metrics & Options (also listed in the More » Options. shortcut), including the number of decimal places reported by the Sholl Results table or the usage of scientific notation. To resize plots, use the More » dropdown menu in the Options dialog. What is the Sholl mask ? The Sholl mask (see example of CA1 cell) is simply an illustration: a maximum intensity projection of the analyzed cell in which intersection counts are used as pixel intensities. As explained in Output Options, its LUT can be modified, and intensities calibrated using ImageJ default commands. As mentioned, it can also be used to visually inspect for segmentation artifacts. The 3D profile looks worse than the 2D profile of the Maximum Intensity Projection of the same cell. Por quê? An anisotropic voxel size will have a strong impact on step size. On the other hand, 2D and 3D images can be sampled differently depending on the options chosen. If Image▷ Properties… ( ⇧ Shift + P ) reports the appropriate spatial calibration, make sure to read Multiple Samples and Noise Reduction before deciding which type of images to use. The program terminates without warnings. O que estou fazendo de errado? The program will not terminate without throwing an error message. However, do note that some exiting messages are displayed in the often overlooked status bar of the main ImageJ window. This is intentional, as it minimizes the frequency of modal windows popping up for each failed operation.

Metrics and Curve Fitting.

Would it be possible to retrieve the Area Under the Curve (linear Sholl plot)? Certo. But it would hardly be relevant for data sampled at fixed intervals. The area under the curve (AUC, the area between the sampled curve and the horizontal axis, i. e., its definite integral) could be estimated using, e. g., the trapezoidal rule. However, because data is always sampled at equally spaced intervals, doing so would be the same as multiplying Mean inters. by the distance between Ending radius and Starting radius. Thus, effectively, AUC is redundant with Mean inters., that is already an integrated measurement of the sampled data. On the other hand, one could retrieve the AUC of the polynomial fit, but such property is already covered by Mean value. The shape of the polynomial changes at the edges of the profile. Por quê? Inflection points at starting/ending radius are usually associated with a poor fit and/or the fact that all the radii in which no intersections were counted are ignored. The latter is required to calculate the Sholl regression coefficient, as log(0) is undefined. None of the fitting options is suitable for my datasets. O que devo fazer? Have a look at Complementary Tools.

The code that the Macro Recorder produced does not seem to work. O que estou fazendo de errado? It is likely that frequent interactions with the dialog prompt(s) (from which the Recorder retrieves user-specified parameters) have "confused" ImageJ. While this process is usually flawless, it may happen that repeated triggering of GUI-specific commands that are not recordable (e. g., Cf. Segmentation or Import Other Data buttons) may lead to an incomplete recording. The solution is to repeat the recording, while minimizing such interactions.

I found a bug. How do I report it? Report it in the ImageJ Forum or file an issue on GitHub. Don't forget to include the steps needed to reproduce the problem. You may also want to check the release notes for the latest development version to see if the issue has meanwhile been addressed.

Releases notes are available on Github. If you do not mind unstable software, development builds may be found here. Once new features mature and no major issues are found these development versions will be made available, as usual, through the Updater.